El joven Luis crece en Belmonte, aprende a leer y cantar con un ayo o tutor, acompaña a su padre en viajes a Madrid y Valladolid. En 1541 ó 1542 Luis probablemente inicia sus estudios formales en un colegio de Salamanca, pero unos meses más tarde lo hallamos de novicio en el Convento de San Pedro, de la Orden de los Agustinos, también en Salamanca. Profesa en 1544, sin dejar de estudiar en la Universidad. El doctorado en teología en aquella época suponía unos nueve años de estudio.
En mayo de 1560 recibía el grado de licenciado, y en junio el de Maestro en Teología. En 1561 compite por una cátedra vacante, de teología tomista, y gana por 108 votos contra 55. Su elocuencia, en castellano y en latín, corre parejas con una inteligencia profunda y creadora. Incluso sus enemigos, que aumentan cada día, reconocen su inmenso talento.
Hijo de don Lope Ponce de León y de doña Inés de Valera, no carecía, como es el caso de tantos españoles ilustres de los siglos XV y XVI, de antepasados conversos. Fray Luis se refiere más de una vez a "los sabios hebreos". Sabemos que lo que en Italia podía llevarse a cabo sin mayor problema, por lo menos hasta Galileo, en España creaba de inmediato dificultades considerables: Castilla estaba pasando por una época conflictiva, y la función del intelectual dedicado sin reservas al oficio de pensar se convertía cada vez más en un oficio lleno de dificultades y sinsabores. Añádanse a ello las envidias y rencillas entre colegas y las hondas rivalidades entre las Órdenes religiosas, en particular entre dominicos y agustinos, y resulta más fácil comprender que el éxito mismo de Fray Luis como pensador, humanista y traductor de textos bíblicos tenía que crearle un hondo conflicto frente a la Inquisición.
En marzo de 1572 Luis de León fue detenido por la Inquisición y encarcelado en los calabozos del Santo Oficio en Valladolid. Había sido denunciado por varios de sus colegas por criticar el texto latino de la Biblia, la Vulgata, y preferir el texto hebreo; por introducir novedades peligrosas en asuntos teológicos; y se le criticaba también haber traducido al castellano el Cantar de los Cantares.
Casi cinco años pasó Fray Luis en una celda oscura, angustiado por no saber, durante mucho tiempo, de qué se le acusaba y quiénes eran sus acusadores. Enfermo -sufría del corazón-, no tenía acceso a su médico. Pero, finalmente, fue absuelto, reivindicado, y todo volvió a la normalidad. Tuvo ocasión de leer, meditar, escribir: algunos de sus mejores poemas nacieron en aquellos días de amargura.
En cuanto a la anécdota más difundida relativa a aquellos difíciles años y al momento de reinvindicación de su inocencia, la famosa frase que Luis de León hubiera pronunciado al reanudar su curso en Salamanca, "Decíamos ayer...", Federico de Onís ha señalado, en forma que parece definitiva, que nos hallamos ante una tradición apócrifa y tardía, que no merece crédito; Luis de León no regresó a su antigua cátedra sino que recibió una cátedra nueva y diferente; los nombramientos a cátedras duraban cuatro años únicamente, y nuestro poeta había renunciado a la suya durante su encarcelamiento. Como símbolo de superación de sus sufrimientos y posible perdón de sus agresores puede tener cierta validez psicológica. Pero el propio Fray Luis prefirió otro símbolo para expresar su actitud: hizo dibujar un roble (una "carrasca") podado o atacado por un hacha: es sabido que la poda mejora el crecimiento de muchos árboles; y en la segunda Oda a Felipe Ruiz escribe:
Bien como la ñudosa
carrasca, en alto risco desmochada
con hacha poderosa.
del ser despedazada
del hierro torna rica y esforzada...
Es decir: en lugar de herirlo o abatirlo, sus enemigos no habían hecho sino acrecentar la fuerza, la energía moral y física, y la creatividad de Fray Luis. Nunca se había sentido tan seguro de sí mismo como después de pasar aquellos años en la cárcel inquisitorial. Ninguna de sus opiniones cambió, antes bien siguió defendiendo sus ideas con tanta o más energía que antes.El resto de su vida lo constituyen una larga serie de triunfos intelectuales y sociales. En diciembre de 1576 es declarado inocente y puesto en libertad. Salamanca le recibe triunfalmente. En 1578 obtiene la cátedra vitalicia de Filosofía Moral; en 1579 oposita nuevamente y obtiene la cátedra de Sagrada Escritura. En 1583 aparece la primera edición de La perfecta casada y la primera parte de De los nombres de Cristo. En 1588 publica en Salamanca Los libros de la Madre Teresa de Jesús. En 1591 es elegido Provincial de su Orden en Castilla. Muere pocos días después en Madrigal de las Altas Torres (Ávila).
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